本篇文章给大家谈谈质谱流式细胞技术，质谱质谱以及质谱流式细胞技术应用对应的流式流式知识点，希望对各位有所帮助，细胞细胞不要忘了收藏本站喔。技术技术

质谱流式---质谱技术和流式技术的完美结合

CyTOF 质谱流式细胞仪利用重金属同位素作为抗体标签，利用质谱技术对细胞蛋白进行定量检测。质谱质谱

该技术的流式流式应用一方面使流式检测通道数量大幅提高到了上百个，提升了从单个样品获得的细胞细胞信息量；另一方面避免了通道间信号的干扰，大大简化了实验设计，技术技术提升了数据的应用可靠性。

通道的质谱质谱增加意味着可以对细胞亚型进行更精准的分群，也意味着可以对细胞内信号通路进行更加全面的流式流式分析；单次实验可捕获百万级别的单细胞，避免遗漏小亚群。细胞细胞广度和深度的技术技术综合，

使得质谱流式成为单细胞水平蛋白组学研究不可或缺的应用工具。

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Helios 质谱流式系统对信号分辨率极高，可同时检测上百种不同的标签。质谱流式可以同时获得单细胞表面 Marker、胞内信号通路、转录因子、细胞因子、细胞周期等等各方面的信 息，在造血、免疫、干细胞、癌症以及药物筛选等多个领域的研究中有着广泛的应用。

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从抗体 Panel 设计到数据分析，每一步都经过科学、缜密的设计，以保障高质量研究成果。

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常见问题

Q

（2）检测系统的不同：前者使用激光器和光电倍增管作为检测手段，而后者使用 ICP 质谱技术作为检测手段。

Q

（2）通道间无干扰，无需计算补偿。

（3）采用独特的金属标签抗体。由于细胞本身不含这些作为标签的金属元素，没有传统流式的“自发荧光”，因此信号背景极低。

（4）多样化的数据处理方式，实现对样品的深入分析。

Q

（1）PBMC 细胞分离。推荐用肝素或者柠檬酸盐作为抗凝剂抽提全血，并在4小时内使用Ficoll 或者 Percol 密度梯度离心法分离出 PBMC。注意需要尽量去除红细胞；

（2）顺铂染色。顺铂可用于区分死活细胞，推荐加入1 uL 终浓度为5 uM 的顺铂，37℃孵育5分钟后加入2~5倍体积的 Cell Staining Buffer，中止反应。其后以300 g的转速离心5分钟， 弃上清后使用 Cell Staining Buffer 或细胞培养基重悬细胞；

（3）细胞刺激（可选）。将细胞转入培养箱培养15~30 min，随后使用相应刺激物进行分组刺激。刺激后的细胞转至离心管，离心后使用 Cell Staining Buffer 稀释至1 mL； 注：此步根据具体需要，短时间的信号通路刺激可以按上述步骤进行；如果做数小时的胞内 Cytokine，该步骤应该放在染顺铂之前。

（4）细胞固定。使用2× 的 fixation buffer（含3.2% PFA 的 PBS）进行固定；

（5）将固定后的样品保存在-80℃。

Targeting YAP-Dependent MDSC Infiltration Impairs Tumor Progression

期刊: Cancer Discovery

影响因子:19.45

发表单位：德克萨斯大学安德森癌症中心

发表时间: 2016年1月

研究背景

对前列腺癌细胞和肿瘤浸润免疫细胞之间信号传导机制的研究可能会开启新的治疗方法。

三、研究结果

1. 通过质谱流式细胞分析技术对17个表面 Marker 进行分析，解析了肿瘤组织中免疫细胞的亚群组成及其随时间的变化趋势。

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图1 组间平均 beta 值差异火山图

2. 红色代表的是骨髓来源的抑制性细胞（MDSC），可以看到其比例随时间明显增大，提示 MDSC 在肿瘤发生过程中具有重要的作用。

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研究结论

本研究通过质谱流式对 PTEN 和 Smad4 缺失的前列腺癌模型进行研究，发现肿瘤浸润免疫细胞主要由 MDSC 组成，且其比例随着癌症的发展不断增高。如果将此部分细胞剔除，病程会 受到抑制。

阅读原文：

首先将表型类似的细胞聚成小群，然后依照各小群的表型相似度进行聚类分析，最后得到一个树形图。

每个节点都是由一群表型相似的细胞构成的，节点相对位置不同也体现了其表型的差异。

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尽可能保持信息不丢失的基础上，将多维信息压缩到二维，这样就可以用二维散点图来展示高维数据的结构。

可以看出，在 viSNE 图谱中，几个主要免疫亚群各自聚群。

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Wanderlust 会根据每个细胞排列的位置赋予细胞一个 Wanderlust 值，其大小就反映了分化程度。

以 B 细胞为例，0代表起点（造血干细胞），1代表终点（Immature Naive B），该数值越小说明细胞越原始。

有了这个工具，我们可以观察 B 细胞分化过程中任意一个蛋白的表达变化，这些信息可以帮助我们找到分化过程中一些重要的事件。

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将不同时间点的质谱流式数据做降维分析，得到的图谱反映了细胞表型随时间的变化。

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临床样本具有很大的异质性，比较有规律性、代表性的差别往往只存在于少数亚群中。Citrus 可分析识别出这些特征性亚群。

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聚类热图可以简单地聚合大量数据，直观地展现数据的频率高低。

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用来呈现数据点的分布，表现两个元素的相关性。

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原文： CyTOF -result

高分文章简单做 「质谱流式」技术干货学一下

发过20 篇论文 这个女博士转行后人生更精彩一个PhD 的日常挑战：怎样找一个适合的细胞分选方法！6 款曲线，解决99% 的ELISA 数据拟合难题我问师兄怎么纯化包涵体，他说…… 流式细胞术以多参数、高分辨率以及快速检测等优点而广泛应用于多个研究领域及临床诊断中，特别是免疫学研究。美中不足的是，在筛选未知细胞群时，传统流式细胞术容易陷入「盲人摸象」的尴尬。而质谱流式技术则能完美解决这一问题，通过检测通道方面的飞跃，目前可同时检测40 多种指标，实现对细胞更为全面的检测。

与传统多色流式实验一样，质谱流式同样需要「烧脑」考虑配色（panel design），在实验前「步步精心」，正所谓一步错，步步错，策划周全的实验方案是获得有效数据的关键。下面就让我们一起揭秘质谱流式，文末更有CyTOF / Luminex 多重检测技术交流会，现场体会质谱流式的魅力。

了解更多质谱流式原理，请查看：质谱流式，一个富二代的自白

特色同位素标记

质谱流式相对于传统流式技术的主要差异在于使用金属元素及其同位素作为抗体标签，目前用作标签的主要有稀土元素、惰性元素、后过渡金属和卤素，这些元素在细胞内含量少，不会引起高背景，也不会影响细胞正常的生理功能，目前用作质谱流式标签的主要同位素如下图所示：

通过这些标签标记的抗体，可以检测细胞相关生物标志物的表达及修饰、细胞活性、细胞功能及细胞周期等。

相较传统流式而言，质谱流式技术中相邻通道的干扰已经降低了很多，然而溢漏现象依然存在，主要由以下几个原因导致：

①.同位素纯度不够（Impurities）。

②. M ± 1，是指相邻通道的溢漏，被称为丰度灵敏度（Abundance Sensitivity），简单说就是质量为M的峰的拖尾，在M + 1和M – 1质量上的信号干扰。

③. M + 16，是指同位素氧化导致的干扰（Oxidation）。如轻镧系元素（139～160 AMU）因为氧化物的形成，导致了对重镧系元素（155~176 AMU）通道产生干扰，目前通过实验体系的优化，最容易氧化的镧系元素同位素的干扰降低到3.0%以下。89Y,102Pd,104Pd,105Pd,106Pd,108Pd,110Pd,113In,115In,和209Bi同位素不会产生氧化干扰，也不会对轻、重镧系元素产生氧化干扰。

（A）质谱流式技术干扰信号源示意图[1]

Chevrier S 等使用单染微球计算出通道间溢漏的矩阵，可作为通道选择的参考，如图B 所示：

（B）基于单染微珠计算的溢漏矩阵。对角线上的值是1。默认情况下，溢漏只计算潜在受影响的通道，包括M ± 1，对应已知同位素纯度，M + 16。小格中的数字表示行中的元素溢漏到列中通道的百分比。最后一列中的数字表示在相应通道中接收到的溢漏信号总量。

Panel Design 基本策略

同传统流式一样，针对不同表达丰度的标志物，也遵循「强弱搭配」原则，即表达丰度高的标志物选择较低或中等灵敏度的同位素标签；表达丰度低的标志物选择高灵敏度的同位素标签。

表达丰度低或未知的抗原：

选择高灵敏度通道，如153–176Ln、209Bi； 选择不会或很少受到其他通道干扰的通道； 可以考虑进一步放大信号，如使用金属元素标记的生物素二抗或多个不同克隆号抗体标记同一指标。

表达丰度高的抗原：

选择较低灵敏度的标签（89Y,102–110Pd,113In,115In）或中等灵敏度的标签（139–152Ln）； 选择不会或很少干扰其他通道的通道； 优化抗体浓度，使用满足需求的最低抗体浓度，从而降低对其他通道的干扰。

此外，还可以遵循以下规则：

①. 互斥抗原（如CD4 和CD8）可以安排在有干扰的通道。

②.共表达抗原（如CD3和CD4）安排在互不干扰的通道。如果无法避免，可以安排下级（如CD4）影响上级通道（如CD3）。

③.设置完善的对照。除实验必需对照外，可以设置Mass-minus-one (MMO) controls，类似传统流式的FMO（荧光减一对照），以此判断通道的干扰。

④.区分单细胞群和活细胞群。质谱流式仪无FSC / SSC参数来区分细胞，因此常使用铱（iridium）或铑（rhodium）的同位素作为核酸嵌入剂，根据DNA含量来识别整体细胞群、区分粘连体和碎片。化学治疗剂顺铂（铂）能够和有损伤的细胞膜共价结合，常被用来区分死活细胞。

技术大咖面对面

由Bio-Techne 主办的「2019 CyTOF / Luminex 多重检测技术交流会」将在深圳举行，邀请您与质谱流式及Luminex 多重检测技术专家面对面，探讨其技术原理、实验设计及最新应用。

一、讲师风采

付国教授，毕业于澳大利亚墨尔本大学。曾任美国Scripps 研究所Staff Scientist。目前就职于厦门大学生命科学院，研究方向为免疫细胞的功能和发育，包括T 细胞和B 细胞的发育、分化、功能及相关信号转导，病原体和宿主的相互作用，肿瘤的免疫监视和治疗等。厦门大学拥有国内首台质谱流式仪，而付国教授是国内最早接触质谱流式技术的学术带头人之一，积累了丰富的经验和研究数据，并成功在质谱流式平台上开发新的试剂和方案。 郭鹏举博士，澳大利亚墨尔本大学博士，联邦科学与工业研究组织博士后。现任广州维佰生物科技股份有限公司技术总监。2005~2010 年在澳大利亚联邦科学与工业研究组织工作，从事干扰素与细胞因子对免疫系统的影响及其相应的基因调控的研究。2010 年11 月回国，先后在广东省兽医研究所和广东省实验动物监测所担任项目负责人，从事动物健康的检测技术，特别是Luminex 的xMAP 和xTAG 技术应用于动物健康检测。回国后共申请国家发明专利52 项，国际PCT 专利11 项，已授权国家发明专利32 项（其中Luminex 技术相关专利17 项），发表SCI 文章32 篇（Luminex 技术相关9 篇）。

二、日程安排

三、时间地点

时间：2019 年5 月26 日 地点：深圳博林天瑞喜来登酒店

四、报名咨询

扫描下方二维码，申请报名；

或在生物学霸公众号后台回复口令「c0526」，申请报名。 如需咨询，请拨打电话：021-52380373 参考文献： [1].Chevrier S et al. Cell Syst. 2018 May 23;6(5):612-620.e5. [2].Han G et al. Nat Protoc. 2018 Oct;13(10):2121-2148. [3].Majonis, D et al. Biomacromolecules 12, 3997–4010 (2011). [4].Behbehani GK,et al. Clin Lab Med. 2017 Dec;37(4):945-964. [5].Laura T. Donlin, et al. Arthritis Res Ther. 2018;20:139.

文章来源：Bio-Techne 图片来源：Bio-Techne、站酷海洛 题图来源：站酷海洛 Image byGerd AltmannfromPixabay

话题： Bio-Techne, 互斥抗原, 共表达抗原, 死活细胞, 氧化干扰, 溢漏现象, 特色同位素标记, 质谱流式, 铂, 铑, 铱

质谱流式细胞技术简介

质谱流式细胞技术（mass cytometry，MC）就是将电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）应用到单个细胞的分析，原理是用纯化的单元素同位素标记抗体，然后使用ICP-MS检测该元素离子峰。该技术融合了流式细胞分选仪和ICP-MS。操作流程简单，如图1所示，首先细胞用带有金属元素（一般是镧系金属）的特异性抗体标记3-4，然后被送入质谱流式细胞仪，细胞以单个细胞液滴状态被雾化后进入高温等离子体，产生自由原子，四级杆选择只通过镧系金属质量范围内的离子，去除其余离子，利用飞行时间质谱（TOF mass spectrometry）检测镧系金属离子的相对信号强度。质谱流式细胞仪由多伦多大学的研究人员首先研发出来，第一台商品化的质谱流式细胞仪名为Cytometry by Time-Of-Flight (CyTOF)，相关抗体试剂由DVS Sciences公司生产和销售。

传统流式细胞术用荧光基团作为报告分子，通过对发射光强度定量以确定目标分子的表达量，但荧光基团发射谱常有重合，尤其是在同一个实验中进行多参数测量的情况下，难以区分多个荧光基团。质谱流式细胞技术使用单一分子量的稳定镧系金属代替荧光基团作为报告分子，元素质谱分析仪能够通过分子量准确区分不同原子质量，并且不同镧系金属质量没有信号重叠，增加了定量的准确性。

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目前，质谱流式细胞技术可以同时对51个靶蛋白进行检测，每秒检测1000个细胞，平均每天可检测100个样品，最低检测限为100个拷贝分子，已经过验证的镧系金属标记抗体种类超过400种；除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰1，蛋白降解产物5，检测细胞存活率，细胞大小，mRNA转录子表达量6，DNA合成速率7以及蛋白酶活性8等的测定。

正如蛋白质组学中的非标记定量，质谱流式细胞技术对靶点的定量准确性也受到不同仪器离子化效率的差异、仪器状态等的影响；同时，传统的质谱流式细胞技术每次只能检测一个样品，通量较低。因此， 质量标签细胞条码技术（mass-tag cellular barcoding，MCB） 应运而生。

细胞经过药物等处理后，用多聚甲醛固定后，使用MCB试剂对不同样本的细胞进行条形码标记，然后将不同样本混合后进行常规质谱流式细胞分析前处理和检测。最终通过检测条形码对应的元素离子，对细胞进行样品归类。

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图2. 多路质谱流式细胞技术

多路质谱流式细胞技术实验步骤如图2所示，不同处理的样本经过甲醛固定，使用不同mDOTA分子对不同样本进行标记，然后进行常规的质谱流式细胞分析的前处理和检测。

这里使用的mDOTA分子是一个双功能化合物，一端可以螯合金属离子，一端则可以和细胞中蛋白上的自由巯基以共价键形式结合（如图3所示），一个mDOTA分子可以螯合一个镧系金属元素原子，那为什么叫barcode呢？ Barcode 就是指可以同时添加多种被镧系金属元素螯合的mDOTA分子，在CyTOF中共价键被打碎后，每种镧系金属元素的峰即可形成有和无两种情况，使用的镧系金属元素螯合的mDOTA试剂的种类越多，最终可组成的条形码种类越多，如图4所示，使用7种镧系金属元素螯合mDOTA试剂，可以组成2的7次方种条形码，即可以同时标记128个样品。 MCB的使用，可以对多个样本同时进行单细胞定量分析，增加了质谱流式细胞分析技术的分析通量，并且增加了相对定量的准确性。 本文一开始提到的那篇Cell Stem Cell的文章，就是利用MCB技术，在单细胞层面研究人源红细胞生成过程中内源转录因子的表达和调控。

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图3. mDOTA分子反应原理

细胞使用双功能分子mDOTA（maleimido-mono-amide- DOTA）以共价键形式进行标记。mDOTA一端可以螯合稀土元素，一端可以和细胞内的蛋白的巯基反应。

但是MCB存在一定的缺陷，首先在每次仪器校正后，质谱流式细胞仪的离子检测灵敏度都会发生变化，尽管可以用内参进行校正，将样品混合后检测会降低样品之间的变化程度； 其次，MCB使用镧系金属元素和后期使用的抗体耦连的镧系金属不能相同，因此MCB的使用缩小了后续标记抗体的选择范围。 因此，后来基于钯元素的MCB试剂被进一步发展出来11。 使用钯元素的6个同位素原子进行MCB分子的构建有以下两点优势： 首先，钯元素因为和标记抗体的试剂（Diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA)-based polymer）不兼容，抗体标记不会使用钯元素，因此MCB分子使用钯元素不会干扰后续标记抗体的选择； 第二，Pd有6个稳定同位素，102, 104, 105, 106, 108和110 amu, 纯度很高，分别为91%, 96%, 98%, 99%, 99%和99%，这些同位素和其他镧系金属元素质量相差甚远，不会影响后续的抗体耦连的镧系金属元素的检测。

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图4. MCB形成原理

使用七种镧系金属元素螯合mDOTA试剂，按图中分布添加mDOTA试剂，可以组成2的7次方种条形码，即可以同时标记128个样品。

最后我们简单说一下这个技术的优缺点。优点是可同时检测的通道比较多，现在可以做到同时检测51个目标蛋白；可操作性强，试剂都是商品化的；速度虽然比不上流式细胞仪（每秒10000个细胞），但也并不慢，每秒可检测1000个细胞；成本低，平均每个细胞测量成本仅需0.005美分，对比单细胞测序技术每个细胞平均22美元，可以说是相当便宜了。

当然，就目前来看，这个技术还存在不少的不足之处。 首先，细胞在分析中被雾化并离子化，在分析后不能保留完整的活细胞状态； 其次，灵敏度低于荧光基团，不能检测极低水平表达的分子，检测的动态范围最多只能达到3-4倍，而荧光基团的检测范围则可到50倍左右；第三，不同仪器之间的离子化效率不同，需要通过掺入聚苯乙烯珠子进行信号强度的校正，实现同一个仪器的数据的比较； 第四，和基于荧光基团的流式细胞技术一样，质谱流式细胞技术仍然不能检测小分子代谢产物，并且不能对一个细胞进行连续的动态监测； 最后，也是最重要的一点，不能对蛋白组中的所有蛋白进行监测，只能对特定目标蛋白进行检测，因此需要更为严谨的实验设计。

不管怎样，质谱流式细胞技术还在不断地发展和改进，我们能利用这个技术解决的问题也越来越多。希望通过这次对质谱流式细胞技术的系统性介绍，也能为大家目前面临的问题提供一点新思路，为大家的课题添砖加瓦。（来源清华大学蛋白质研究技术中心蛋白质化学与组学平台）

参考文献：

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4. Majonis, D.; Herrera, I.; Ornatsky, O.; Schulze, M.; Lou, X. D.; Soleimani, M.; Nitz, M.; Winnik, M. A., Synthesis of a Functional Metal-Chelating Polymer and Steps toward Quantitative Mass Cytometry Bioassays. Anal Chem 2010, 82 (21), 8961-8969.

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11. Zunder, E. R.; Finck, R.; Behbehani, G. K.; Amir, E. D.; Krishnaswamy, S.; Gonzalez, V. D.; Lorang, C. G.; Bjornson, Z.; Spitzer, M. H.; Bodenmiller, B.; Fantl, W. J.; Pe'er, D.; Nolan, G. P., Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc 2015, 10 (2), 316-333.

质谱流式细胞技术的介绍就聊到这里吧，感谢你花时间阅读本站内容，更多关于质谱流式细胞技术应用、质谱流式细胞技术的信息别忘了在本站进行查找喔。